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一般情况下鱼缸水质良好时弧菌不会对生物造成伤害，但水质变差或波动时弧菌有可能会趁虚而入，本帖主要对fot缸有参考意义。 1. TCBS培养基显色原理 弧菌是海水环境中的常在菌群，广泛分布在自然海区，是一种条件致病菌，但当动物受伤、体弱、抗病力降低和环境条件恶化时，弧菌会乘虚而入，引起发病。 弧菌有许多致病种类和菌株，可引起皮肤溃疡、烂尾、烂鳍、出血等症状，导致动物对外界反应迟钝，摄食率下降或停止摄食等，严重可导致大量死亡。 目前常见使用TCBS琼脂培养基进行水体中的弧菌检测。 TCBS 琼脂培养基，即硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基。 用途：用于霍乱、副溶血性弧菌的分离培养。 成分： 蛋白胨10.0g，酵母粉 5.0 g，氯化钠10.0g，柠檬酸钠（2H2O）10.0g，牛胆汁粉5.0g，蔗糖20.0g ，柠檬酸铁1.0g，胆酸钠3.0g，硫代硫酸钠（5H2O）10.0g，溴麝香草酚蓝0.04g， 麝香草酚蓝0.04g, 琼脂15.0g， pH值8.6 ± 0.2。 TCBS培养基中各成分作用： 培养基中的蛋白胨、酵母浸粉提供碳氮源、维生素和生长因子； 氯化钠提供嗜盐弧菌的最佳生长和代谢条件，并形成高渗透压，使其他一些细菌很难生长； 蔗糖是可发酵的糖类，利用指示剂来区分是否发酵蔗糖； 柠檬酸铁和硫代硫酸钠是硫化氢指示系统，如果待测菌产生硫化氢，与指示剂反应产生黑色沉淀，使培养基变黑。 胆酸钠、牛胆粉、硫代硫酸钠和柠檬酸钠及较高的pH可抑制革兰氏阳性菌和大肠菌群； 碱性条件能够在一定程度上抑制肠道菌的生长，也能促进霍乱弧菌的生长，霍乱弧菌对酸性条件敏感； 琼脂是培养基的凝固剂; 溴麝香草酚蓝，麝香草酚蓝这两个化合物是指示剂。 溴麝香草酚蓝是一种酸碱指示剂，变色范围pH6.0(黄)~7.6(蓝)，较低浓度的CO2使其由蓝变绿，较高浓度CO2使其由蓝变绿再变黄，当中过渡颜色是绿色。 麝香草酚蓝有两种变色范围：（1）酸范围为pH1.2（红色）～2.8（黄色）；（2）碱范围为pH值8.0（黄色）～9.6（蓝色）。 其中培养基上菌落显色原理如下： 凡是不能发酵蔗糖的弧菌就不产酸，只能利用柠檬酸钠作为碳源，然后生成碳酸盐，使培养基pH升高，在 TCBS培养基上都是蓝绿色（或深绿色）； 能够发酵蔗糖的弧菌可以产酸（乳酸），使培养基pH降低，在TCBS培养基上的颜色就为黄色。 如果菌株能够产生H2S，则遇到培养基中的铁离子（柠檬酸铁）就会生产FeS显示黑色。 培养皿中出现培养时间稍长黄色菌落转变为绿色菌落原因：利用蔗糖后产生乳酸在培养基上呈黄色菌落，培养时间过久，蔗糖消耗完后，营养缺乏，某些菌种能够利用乳酸，将乳酸分解后菌落颜色由黄色变绿色，误判为绿弧菌，解决方法为将培养基倒厚，培养时间适中。 TCBS培养基上几种颜色和大致判断菌种： (1) 绿色：副溶血弧菌、河流弧菌、恶臭假单胞菌 (2) 黄色：溶藻弧菌、霍乱弧菌、哈维弧菌、鳗弧菌、温和气单胞菌 (3) 淡黄无色：变形杆菌、肠球菌 (4) 蓝色：假单胞菌、气单胞菌 (5) 蓝绿色：创伤弧菌 (6) 中间黑，边缘黄：变形杆菌 (7) 芽孢杆菌可在该培养基中生长显黄色菌落 2. 弧菌检测的操作规范 2.1 方法原理 平板计数法是根据单一的细菌在平板培养基上，经若干时间培养，可形成一个肉眼可见的子细胞群（菌落）（亦即一个菌落代表一个细胞），通过计算菌落数而得知细菌数的。计数关键是必须尽可能将样品中的细菌分散成单个细胞，并制成均匀的不同浓度稀释液，将一定量的稀释液均匀地接种到盛有固体培养基的培养皿上（以下简称平皿）。 2.2 实验仪器与材料：
（1） 培养皿：直径90mm； （2） 恒温培养箱（37℃）； （3） 超净工作台； （4） 电炉：2000W； （5） 离心管（2/4mL）； （6） 无菌涂布棒； （7） 移液枪（100µL、1mL）； （8） 移液枪头； （9） 锥形烧瓶 （10） 牛皮纸 （11） 酒精灯
2.3 培养基制备 (1) 将TCBS琼脂按照89.10g/1L 蒸馏水的比例混合，加热煮沸，使其充分溶解； (2) 待琼脂溶液 温度冷却 至约55℃ ，倒入直径规格为90mm的无 菌平 皿（15mL/平皿）中，静置 冷却凝固约2.0h ，用封口膜封好，置4℃冰箱内（可保存15d）或常温（可保存5~7d）保存，待 用。2.4 测定步骤 2.4.1 水体的弧菌检测方法 (1) 提前约1.0h将已配制的培养皿倒置于超净工作台，并使平皿与皿盖保持半开状态，同时开启紫外光照射，使其内部水蒸气充分挥发，避免污染。 (2) 以无菌操作方法吸取水样注入盛有灭菌生理盐水的离心管内混匀，并依同法依次连续稀释至所需要的稀释度（10、10-1、10-2等）。稀释度依水样含菌量而定，以每平皿的菌落数在30个~300个之间为宜。每种稀释度需有3个平行样； (3) 取稀释好的水样0.1mL，滴入备好的平皿上，用灭菌玻璃涂布棒将菌液涂抹均匀（于酒精灯外焰附近进行操作），并写好标签，平放于超净工作台上20~30min，使菌液渗入培养基； (4) 将平皿倒置(皿盖贴下面)于37℃恒温培养箱内进行培养。培养24h观察平皿上的菌落生长情况，并进行菌落计数。 2.4.2 弧菌检测方法 (1) 提前约1.0h将已配制的培养皿倒置于超净工作台，并使平皿与皿盖保持半开状态，同时开启紫外光照射，使其内部水蒸气充分挥发，避免污染。 (2) 将鱼倒到过滤纱布上，用无菌水来清洗，将黏附在鱼上杂质清洗干净；用经酒精灯火焰灼烧过的镊子(冷却后使用)取出部分组织放到离心管中；再加无菌水清洗两遍。向装有组织的离心管中加入0.4mL生理盐水稀释5倍，用研磨棒将组织捣碎，然后放在振荡器上振荡，使其充分混合。取100µL的样本加入到已经装有900µL生理盐水的离心管中，再次振荡使其充分混合。 (3) 取稀释好的混合液0.1mL，滴入备好的平皿上，用灭菌玻璃涂布棒将菌液涂抹均匀（于酒精灯外焰附近进行操作），并写好标签，平放于超净工作台上20~30min，使菌液渗入培养基； (4) 将平皿倒置(皿盖贴下面)于37℃恒温培养箱内进行培养。培养24h观察平皿上的菌落生长情况，并进行菌落计数。 2.5 菌落计数方法 (1). 用肉眼直接观察，必要时用放大镜或菌落计数器检查，以防遗漏。平行组的3个平板的菌落数应该接近，不同稀释度的几个平皿上菌落数则应与水样稀释倍数成反比，即水样稀释倍数越大，菌落数越低，稀释倍数越小，菌落数越高。 (2). 菌落计数时，应选取菌落数在30～300之间的平板作为菌落数总数测定的标准。一个稀释度3个平行样，菌落数应该很接近，应取3个平板的平均数；如在一个稀释度的两个平板中，一个平板的菌落数在30～300之间，另一个大于300或小于30时，则以菌落数在30～300间的平板作为菌落计数的标准。 表1 不同条件下菌落计数方法 | | | | 若平均菌落数∈(30, 300)，则取菌落数×稀释倍数； 若各平板差异较大，其他稀释度无明显差异，以其他稀释度的平均菌落数为准。 | | 若菌落数均∈(30, 300)，则由稀释倍数较高菌落数与稀释倍数较低菌落数比值决定： 若比值≥2，则取较小的值计数； 若比值＜2，则取均值计数。 | | (1). 若所有稀释度的平均菌落数均＞300，则取最高稀释度的平均菌落数×稀释度； (2). 若所有稀释度的平均菌落数均＜30，则取最低稀释度的平均菌落数×稀释度； (3). 若所有稀释度的平均菌落数均=0，则取1×最低稀释度为菌落数； (4). 若所有稀释度的平均菌落数均∉(30,300)，则取接近30或300的平均菌落数×稀释度。 | | (1). 若有较大片状菌落生长时，则不宜采用； (2). 若片状菌落不到平板的一半，另一半菌落数分布很均匀，则此半个平板计数后乘2以代表全皿菌落数； (3). 若出现链状菌落，以一条链作为一个菌落计 。 |
2.6 注意事项 (1). 操作过程应在无菌环境下进行； (2). 将水样滴加至培养基前，应保证培养基呈半干状态，避免涂布不均匀，影响检测结果； (3). 稀释水样采用无菌生理盐水； (4). 涂布前应避免涂布棒温度过高，否则会使部分菌落被烫死。 以上为实验室操作，个人可以酌情简化操作。
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珊海观
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发表于 2021-11-29 21:00
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发表于 2021-11-30 07:45
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