【转帖】公子小丑鱼（Amphiprion ocellaris）胚胎发育的形态学...

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1.2幼体培育系统
   仔鱼，幼鱼养殖在800L的圆柱形塑料桶中，桶中央固定一个气石，温度用加热棒来控制。
1.3 培育用水
   试验用水为以色列RED SEA海盐和淡水配制而成。
1.4 生物饵料培养
    小丑鱼仔幼鱼生长所需要的生物饵料主要为轮虫和卤虫无节幼体。轮虫需要投喂小球藻才能存活和不断繁殖。卤虫无节幼体用幸运牌卤虫卵孵化得到，投喂时把虫体和卵壳以及没有孵化的虫卵分离。
1.5 仔幼鱼对饵料的需求
仔、稚鱼培养期间的水温控制在27℃±1℃，pH为8.0-8.2，盐度控制在27-29，氨氮量低于0.1 mg/L。仔鱼孵化后前三天投喂用小球藻强化的轮虫，轮虫的密度保持在10~15个/ml左右。第四天开始投喂轮虫并开始投喂卤虫无节幼体，此期保证轮虫的密度保持在5个/ml左右，卤虫无节幼体的密度保持在3个/ml左右。第七天开始全部用卤虫无节幼体投喂，卤虫无节幼体的密度保持在5个/ml左右，第十天以后投喂用小球藻强化培养的卤虫，可根据稚鱼的体长培养大小相适应的卤虫。一个月后可以投喂小颗粒饲料和自制人工配合饲料。每天下午吸出缸底的污物，每天更换水体1/10的左右的水。

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2 实验结果  
2.1 亲鱼产卵
  公子小丑鱼亲鱼一般在白天产卵，产卵时雌鱼的输卵管明显伸长，雄鱼的输精管也伸长，雌鱼身体抖动，依次将卵粒排在瓦罐上，雄鱼以相同的动作排精，雌鱼身体抖动一次可产卵几十粒，然后雄鱼排精，以此往复几十次，鱼卵为粘性卵，排列紧密，在瓦罐上形成大约3cm×5cm的卵块，产卵一般持续60min，平均产卵量为200~500。
2.2  受精卵人工孵化
公子小丑鱼的胚胎发育在26度左右需要200h，产卵后160h眼睛开始变亮，反光性极强，这是判断孵化时间的重要标志。孵化当天用气石调节适量的气流吹动受精卵，以模拟亲鱼用鳍扇动受精卵，防止其缺氧死亡。孵化率在90%以上。
2.3 仔幼鱼的孵化率和成活率
根据从2011年2月至9月对18批公子小丑鱼仔幼鱼的孵化率的统计，其孵化率高达93.23±5.56%。鱼苗前十五天的成活率如图所示，孵化后当天成活率接近100%，第二天部分体质较差的鱼苗开始死亡，成活率大幅下降。孵化后的第四天部分生长快的鱼苗开始摄食卤虫无节幼体，而一部分体质较差，竞争力较弱的鱼苗由于无法摄食足够的轮虫，也开始部分死亡，使成活率有所下降。孵化后第十天，由于鱼苗在这个阶段很贪吃，有部分鱼苗撑死导致成活率降低。
鱼苗在孵出的第2d，全长4.2～4.4mm,为仔鱼期，成活率为68.21±2.76%；第5d变态为稚鱼,全长5.1～5.3mm，成活率为39.67±3.34%;第15d开始进入幼鱼期,全长9.5～10.53 mm，，成活率为20.35±1.78%。

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3讨论
    公子小丑鱼雌性成熟时间较晚，由人工养殖爱好者报道的来总结，小丑鱼从人工孵化到产卵需要两年以上，所以购买人工繁殖三个月大的幼鱼来作为亲鱼配对周期太长。亲鱼的来源主要就集中于野外捕捞。野外捕捞又可分为网捕和药捕，网捕成本较高，而且数量有限，所以市场上见到的大部分海水观赏鱼都来自氰化钠捕捞，但是采捕后由于氰化物的毒性和长途运输中的氨中毒，公子小丑鱼暂养时如果处理不当会有超过80%在十天内死亡。
由于氰化物的毒性和长途运输中的氨中毒，小丑鱼非常虚弱，这个时候不用喂食，并按水体体积滴入少量的水质稳定剂。由于其身体虚弱导致渗透压调节能力的降低，所以选择盐度为25-30，防止因盐度变化过快引起的应激。此时要保证水质尽量接近珊瑚礁海域的水平。
由于一个野生小丑鱼家族中只有一只为雌鱼，有几条相对较大的为雄鱼，而大部分都是没有成熟的雄鱼。所以配对时应选择体长在8cm以上的作为雌鱼，由于由雄鱼变为雌鱼的过程是不可逆的，所以最好选择体长7cm以下的较大个体为雄鱼。雌雄比例可以按1:1,1:2,1:N等，一条雌鱼和多条雄鱼可以增加配对的成功率，配对成功的两条小丑鱼会共同生活在一个瓦罐里，并且会驱赶其他没有配对的雄鱼，这个时候就可以把没有配对的雄鱼捞出。
    如何配对和促使亲鱼成熟产卵是公子小丑鱼繁殖过程中的难点，曾观察到配对后正在产卵的一对亲鱼中雄鱼死亡的情况，将另一对尚未产卵的雄鱼与此雌鱼配对，十天后新配对的亲鱼重新产卵。以此推测性成熟的雌鱼能刺激或加快未成熟的雄鱼性成熟，或者公子小丑鱼配对后未产卵的原因是雌鱼未性成熟，显然雌鱼是否性成熟对一对小丑鱼能否产卵起着更为关键的作用。
充气对鱼卵的孵化非常重要，自然状况下鱼卵的胚胎发育需要亲鱼不断地用鳍扇动鱼卵来补充氧气，人工孵化时考虑到亲鱼养殖在循环水系统中，鱼苗孵化后会被水流带到过滤缸，所以附着有受精卵的产卵罐要拿出单独的充气孵化，气石充气的位置不对，会导致没有被气流吹动的受精卵缺氧白化死亡。所以，人工孵化时要调整气石和产卵罐处于一个合适的位置，使所有的卵都能被气流吹动，而且尽量注意不要碰到孵化缸，以免产卵罐的位置发生偏移。气流的大小也有讲究，气流太大会导致没有到孵化时间的受精卵直接被气流吹掉，而气流太小又会导致受精卵的缺氧死亡。
公子小丑鱼的孵化时间会受到光照和温度等的影响。在适宜的范围内，温度越高，孵化时间越短。公子小丑一般在晚上的黑暗环境下孵化，如果孵化过程中受到外界光源的影响，会导致孵化时间推迟，孵化率降低。
在公子小丑鱼人工育苗中,生物饵料的培养是一个非常重要的环节。公子小丑鱼仔鱼孵出之后, 卵黄囊已消耗殆尽,孵化后即需要开口摄食轮虫。鱼苗养殖过程中要注意生物饵料的投饵量,尤其是在稚鱼期要严格控制卤虫的投喂量,因为稚鱼在这个阶段很贪吃, 如果投喂过量,很容易导致稚鱼撑死。投喂刚孵出的卤虫时，应注意把活体和卵壳以及未孵化的卤虫卵分离。公子小丑鱼在仔、稚鱼期只能用天然饵料来喂养,因为在这个阶段,没有完整的消化系统,体内的消化酶缺乏,摄食到卤虫卵壳会使鱼苗消化不良导致死亡。目前的配合饵料大多无法满足这阶段的需求。
在本次试验中有其他因素也对小丑鱼胚胎发育产生影响。鱼卵的胚胎发育在完全充气孵化和亲鱼照看两种情况下比较，亲鱼照看比充气孵化的速度要快，鱼卵的孵化时间会提前1天，而且亲鱼照看受精卵的孵化率的比人工充气孵化率的要高。在亲鱼产卵期，领域性很强。

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第二章 公子小丑鱼胚胎发育的形态学观察

由于受人工繁殖技术和生产规模的局限，目前市场上销售的公子小丑鱼仍以捕捞野生自然群体为主，并多用氰化物等有毒化学品进行捕捞，采捕后由于氰化物的毒性和长途运输中的氨中毒，能够作为商品进入市场的不足20%[2]，而且氰化物还会伤害无法逃避的珊瑚等海洋生物，破坏珊瑚礁区的生态平衡，所以海水观赏鱼的大规模商业化人工繁育就变得势在必行。目前国内外已有不少学者对公子小丑鱼的生理生态、繁殖发育做了初步研究[4-7],并成功进行了人工育苗和批量化生产,但规模仍较小，满足不了市场所需。为进一步探讨公子小丑鱼的繁殖与发育生物学规律，改进人工繁殖技术，本文研究了该种类胚胎发育的全过程,描述了胚胎发育过程中的形态结构变化,并与相关研究进行了比较分析，以期为未来海水观赏鱼的人工繁育提供理论依据。
1 材料与方法
1.1  实验用鱼和养殖管理
   公子小丑鱼亲鱼于2010年4月从浙江海水养殖研究所购入，暂养一个月后，选择体长超过7cm的为雌鱼，不超过6cm的为雄鱼，共配成5对，配对的雌鱼平均体长为8.1cm，雄鱼为5.6cm。每对亲鱼分别放入斑马鱼系统中40cm×30 cm×20 cm的亚克力缸中，每个缸中都放有产卵罐，用来让亲鱼栖身产卵并作为受精卵的附着基，所有的缸都共用一个水处理系统。
   控制亲鱼养殖水温为26℃±1℃，pH为8.0-8.1，盐度为27-29，光照2500 -5000lx，NH3-N水平低于0.5mg/L,NO2-N水平低于0.15 mg/L，NO3-N水平低于50mg/L。水温通过水系统中加热棒控制。每天下午用虹吸管吸出缸底剩饵，及时补充因虹吸损失的水，每三天检测并调整一次盐度。在水系统中适量培养羽毛藻等水生植物来调控改善水质。每天投喂由鲜虾肉，鱿鱼，蛏子，冰冻卤虫，冰冻红虫，螺旋藻等混合而成的自制配合饵料。分别于上午10:00和下午4:00投喂2次。
1.2  胚胎发育观察
   亲鱼一般上午11:00左右产卵，受精卵由动物极一端的附着丝粘附在产卵罐上，产卵结束后立即对受精卵进行取样，为防止反复拿出产卵罐会影响到亲鱼，用一个新的产卵罐来代替附着有受精卵的产卵罐，把附着有受精卵产卵罐放入斑马鱼系统中另一个小缸中，温度光照条件和产卵缸保持一致，并放入一个气石充气吹动受精卵，以模拟亲鱼用鳍扇动受精卵，以防止其缺氧影响发育。
   产卵当天每0.5h取样1次，第2d每1h取样1次，第3d每2h进行1次取样，第4d每4h进行1次取样，至第5d开始每6h取样1次，直到鱼卵孵化。每次取样观察5-10个受精卵。取样时，用巴氏滴管将鱼卵的附着丝铲断并吸入滴管，然后取样置于载玻片上，在奥林巴斯SZX16体视显微镜下对样品进行形态学观察、记录各阶段的形态特征、计数胚胎心跳数,在电脑上用Image-ProExpress 6.0高级图像处理软件控制与显微镜连接的Micro-Publisher™5.0 RTV相机进行拍照，并进行图片分析，测量卵径并绘图。
2 结果与分析
    根据不同时期胚胎发育的形态学特征,可将整个胚胎发育过程分为卵裂前期、卵裂期、囊胚期、原肠期、神经胚期、体节期、翻转期、血管形成期、器官形成完善期、孵化期等10个不同时期

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2.1 卵裂前期
    受精卵呈长椭圆形，长径2.0mm±0.1mm，短径0.90mm±0.1mm，长径约为短径的1倍。卵膜无粘性，富有弹性，位于动物极一端纤维状的附着丝附着在瓦罐上。卵黄呈橙黄色，有一个直径约0.32mm大的油滴和许多小油球无规则地散布在卵黄中。受精卵吸水膨胀而举起卵膜，使卵膜与卵黄囊之间形成围卵周隙，植物极的围卵周隙比动物极大。卵黄囊在卵黄周间隔形成以后变小，整个卵的长度也有所增加。卵黄上的原生质不断向动物极集中，受精一小时后，胚盘形成,从侧面观可见胚盘如帽状隆起，为一个大细胞，标志着准备期的结束。此期受精卵由于吸水膨胀，长径由约2.0mm伸长到约2.3mm，后期长径变化不大。（图版Ⅰ-1,2 Ⅱ-1,2）
2.2 卵裂期（1h）
    受精后1.5h受精卵在胚盘顶部中央产生一裂痕并逐渐加深形成分裂沟，把胚盘一分为二，形成大小相似的2个分裂球，进入2细胞期（图版Ⅰ-3 Ⅱ-3）。受精后2h在第一道分裂沟的垂直位置出现第二道分裂沟，进入4细胞期（图版Ⅰ-4 Ⅱ-4），2.5h进入8细胞期，3h进入16细胞期（图版Ⅰ-5 Ⅱ-5），16细胞期时细胞还只有一层，均匀分布在卵黄囊上，3.5h左右进入32细胞期（图版Ⅰ-6Ⅱ-6）。32细胞期后，胚盘上的细胞愈分愈小，呈不规则排列，细胞会继续分裂成64细胞期。在64细胞期后，细胞继续变小并开始重叠，卵裂球细胞逐渐排列为两层，标志着卵裂期的结束。属典型的端黄卵盘状卵裂。（图版Ⅰ-7 Ⅱ-7）
2.3 囊胚期（5h）
    经过卵裂，受精卵被分割成很多小细胞，细胞边界无法分辨，胚盘与卵黄之间形成囊胚腔，囊胚中部突起呈帽状。受精后5h胚胎发育至囊胚阶段，随后囊胚隆起逐渐降低，并向卵黄部分下包，进入囊胚晚期。此期可根据囊胚的高低分为高囊胚和低囊胚。（图版Ⅰ-8,9,10 Ⅱ-8,9,10）
2.4 原肠期（10h）
   受精后10h起胚盘不断从动物极向植物极下包，当下包达卵黄l/4左右时，胚盾出现，胚盾处的内卷边缘为背唇，进入原肠前期（图版Ⅰ-11 Ⅱ-11）。此后胚层继续向下扩张，当下包达卵黄的1/2时，胚环明显，为原肠中期（图版Ⅰ-12 Ⅱ-12）。之后胚层继续下包至卵黄的3/4左右时，胚层内部的细胞开始向一侧集中、伸展，出现胚体的雏形，胚层外部细胞仍然包裹卵黄，形成胚外膜，进入原肠后期（图版Ⅰ-13，14 Ⅱ-13，14）。此期油滴的数量开始明显变少。

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2.5 神经胚期（20h）
受精后20h胚层下包至卵黄的4/5左右，胚体背面变厚，神经板形成，中央可见一条圆柱形脊索，胚体紧贴在卵黄囊上。胚环逐渐下包收缩形成胚孔。受精后21.5h，胚层下包整个胚胎，胚孔闭合。胚体前端出现头部的雏形，并出现两个眼原基，即视泡。（图版Ⅰ-15 Ⅱ-15）
2.6 体节期（22h）
受精后22h能明显观察到6体节（图版Ⅰ-16），之后体节会随着发育明显增多，26h可看到15个（图版Ⅰ-17），28h为18个，35h为25个。受精后26h胚体和胚外膜开始有黑色素细胞出现（图版Ⅰ-17），此后黑色素细胞形成的色素点不断变多﹑变大(图版I-18,19,20, 21)，卵的外观也由早期的橙黄色开始逐渐变为浅棕色。胚体逐渐变长，头部不断向动物极移动，受精后32h尾巴离开卵黄并不停地抽动，但胚体依然紧贴卵黄囊。随着卵黄逐渐被胚体发育所消耗，开始逐渐变小，使胚外膜与卵黄囊之间逐渐形成空腔，主要分布在动物极，油滴的数量继续变少。此期胚体自然朝下。（图版Ⅰ-16 ,17 Ⅱ-16 ,17）
2.7 翻转期（35h）
    受精后35h胚体头部开始逐渐从动物极翻转到植物极，与此同时尾部也由植物极翻转到动物极(图版I-18,19,20,21)，胚外膜与卵黄囊之间的空腔由于受到胚体的挤压而由动物极转移到植物极，受精后50h心脏出现在此位置(图版I-21 )，位于胚体头部和卵黄囊之间，可以明显看到心脏的跳动，此时的心脏还只是一层膜，位于翻转之前胚体尾部所处的位置。此期视杯形成，具有不透明的眼珠(图版I-20)。胚体背腹面逐渐形成鳍褶，背、尾、臀、腹鳍褶连成一片，在尾部尤其明显。头部、心脏和胚外膜出现放射状的黑色素细胞团(图版I-21)，视杯开始出现黑色素细胞，但是颜色不是很深，小的油滴开始消失，只剩下一个大的油滴逐渐从卵黄中部移动到靠近植物极的位置。胚体不时在卵膜内抽动。（图版Ⅰ-18,19,20,21 Ⅱ-18,19, 20,21）
2.8 血管形成期（56h）   
    出现明显的血液循环，血液由心脏泵出后向上经过脑部，然后沿胚体向下，直至尾基。到达尾基后折返沿胚体回流，到达胚体与卵黄连接处时开始进入卵黄囊表面的血管(图版I-22)，即胚体外的血管系统，胚外血管绕卵黄囊表面半周，最后回到心脏(图版I-23)。胚外血管比胚内粗几倍，在血液径流量相近的条件下血流速度比胚内慢。此时心脏刚刚形成，心跳次数还不是很快，所以导致大量血细胞在进入心脏前，聚集在心脏前端的胚外血管内，由心脏慢慢泵入。胚外血管形成的位置，与翻转期前胚体与卵黄囊紧贴的位置很接近。视泡比翻转期明显变大，黑色素细胞明显增多。受精后64h心跳每分钟80次。（图版Ⅰ-22 ,23 Ⅱ-22 ,23）
2.9 器官形成期（72h）
前期有眼睛、肌节、耳石、脑泡、心脏等器官已显现雏形，胸鳍原基出现，心脏每分钟跳100次左右(图版I-24)。此后，胚胎的循环系统、消化系统、神经系统和视觉系统等得到进一步的发育，心脏跳动的次数逐渐增加。卵黄囊急剧变小，胚外膜逐渐增厚并最终成为胚体的腹部表皮包裹卵黄，卵黄的位置则在此期和孵化后出现体腔。胚体迅速变大，并逐渐占据卵内的几乎所有空间，并在卵内不停地运动(图版I-25)。受精后147h解剖卵后发现胸鳍已经很长，腹鳍原基形成，臀鳍、尾鳍和背鳍仍然连成一片，颌和鳃盖频繁的张开和闭合。在将要孵化的前一天，胚胎在卵壳中卷曲，头部占到整个胚胎的1/3，尾巴连接到了眼睛，眼睛开始发亮，反光性很强，围心膜完全形成，心脏每分钟跳动170-175次，嘴的轮廓已经形成但还没有完全张开，消化道在身体的左侧可见。黑色素细胞逐渐消失，最后只剩下一些很小的色素点。（图版Ⅰ-24,25 Ⅱ-24,25）
2.10 孵化期（199h）
胚胎发育无论白天黑夜都在进行，但孵化需在天黑后约一个小时以后进行，此时胚体长度已接近卵径的两倍，胚胎分泌孵化酶将卵膜溶解，胚体粗壮的尾部挣破卵膜孵化而出，整个孵化过程需要大约半个小时。此时心跳频率达到每分钟180次左右。仔鱼全长4.2－4.4mm,身体透明，卵黄囊营养已经消耗殆尽。（图版Ⅰ-26 Ⅱ-26）

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3 讨论
3.1 胚胎发育过程
公子小丑的卵裂方式为盘状卵裂, 与已研究过的鲈形目其他几种小丑鱼相同[24,25,28,30,32]。多数鲈形目种类如鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)[33]、云纹石斑鱼(Epinephelus moara)[34]、大鳍弹涂鱼(Periophthalmus magnuspinnatus)[35]、大眼鳜(siniperca kneri Garman)[36]等受精卵呈圆球形。而公子小丑的卵则呈长椭圆形，胚胎发育的卵裂期只能从动物极一面观察，需用特殊方法使卵竖立起来，即使如此分裂球也会因附着丝阻挡而影响观察和拍照。
    和红小丑一样，公子小丑受精卵无黏性，富有弹性，靠动物极一端纤维状的附着丝附着在产卵板上。鲍鹰等[28]等在对红小丑人工育苗与胚胎发育研究中指出红小丑为黏性卵，但红小丑与典型的粘性卵瓯江彩鲤(Cyprinus carpio var．color)[37]等有区别。把受精卵从产卵罐上铲下后，会沉入水底，说明其密度比海水大，但叫做沉性卵也不是很恰当。综合以上特点，作者认为把公子小丑受精卵称为附着性卵较为合适。
在胚胎发育的受精卵吸水膨胀后，长径由约2.0mm伸长到约2.3mm，有所增大，这与Yasir等[4]认为虽然受精卵吸水，但是卵的长径并未变化的研究结果不一致。
    本研究在原肠期着重关注了胚外膜形成，这在Yasir等[4]和Liew等[5]对公子小丑的胚胎发育研究和其他学者对另外几种小丑鱼的研究中都未提到，其他一些与鱼类胚胎发育相关的文献中也很少涉及。胚外膜可以解释卵黄外黑色素细胞的沉积，卵黄上血管的形成及最后胚体腹部表皮的形成。胚外膜与卵黄囊之间的空腔则与心脏的形成和后来的体腔有着一定的联系。
一般鱼类的血液和血管都在胚体内发生，后来再伸展和流入卵黄囊的表面构成胚体以外的血管系统[38]。卵黄囊表面的血管系统对胚体快速的吸收卵黄营养起着很大的作用，但在以往的学者对几种小丑鱼的胚胎发育研究中，只有Yasir等[4]提到了卵黄上出现的血流，本研究特别注意观察了胚体外的血液循环。楼允东等[38]指出胚外血管系统的内皮是由心细胞团的一组细胞以增殖方式散布到卵黄囊的表面，同时本研究发现胚外血管形成的位置和翻转期前胚体与卵黄结合的部位十分相近，所以推测心细胞团的细胞可能沿翻转期前胚体与卵黄结合的部位做增殖生长。
3.2 孵化时间
鱼类胚胎发育时间主要与水温有关，在适宜孵化的温度范围内，温度越高，孵化时间越短。Liew等[5]指出公子小丑在27.5±0.5℃条件下胚胎发育需要180h，本研究中公子小丑鱼26±1℃条件下，则需要200h孵出仔鱼。
另外胚胎发育时间与受精卵的大小也有一定的关系, 在孵化温度基本一致的情况下，一般个体越大所需的发育时间越长。比较几种小丑鱼，鞍背小丑[24]长径为1.9-2mm，胚胎发育时间为148±8h。线小丑[32]长径为2.0-2.1mm，发育时间为152h。黑边公子小丑[30]长径为2.0-2.3mm，发育时间为151-152h。公子小丑长径为约2.3mm，发育时间为180-200h。红小丑[28]长径为2.6mm，经过216-240h孵出仔鱼。
小丑鱼与鲈形目的其他海产鱼类的胚胎发育时间有很大的区别，在水温相近的条件下，鞍带石斑鱼[33]胚胎发育时间为18h 30 min，点带石斑鱼(Epinephelus malabaricus)[39]的发育时间为21h，大黄鱼（Pseudosciaena crocea）[40]的胚胎发育时间为26h 36min，云纹石斑鱼[34]的发育时间为40h 37min，小丑鱼的孵化时间要比这几种鱼大几倍。鞍带石斑鱼大黄鱼、云纹石斑鱼、点带石斑鱼等孵化时，其卵黄尚未消耗完，可以继续维持仔鱼继续发育，直至其出膜后72h左右开口摄食。而小丑鱼类孵化时卵黄基本耗尽，孵化后即需要开口摄食，虽然尾鳍、臀鳍、背鳍连成一片，但是腹鳍已开始发育，胸鳍已相当发达，仔鱼可以在水中自由摄食。鞍带石斑鱼等仔鱼前几天无论是主要器官还是各鳍的发育情况与小丑鱼胚胎发育最后几天的发育情况相近，这也是小丑鱼胚胎发育时间更长的一个原因。小丑鱼孵化时各个器官功能更加完善，鱼苗成活率更高，这也可能是对复杂珊瑚礁海域生态的一种自然适应结果。
3.3 胚胎颜色的变化
在公子小丑胚胎发育的过程中,产生了与不同胚胎发育阶段相对应的颜色变化。最初受精卵为橙黄色,随后颜色加深,至翻转期胚胎呈浅棕色,随后棕色变深，但是在器官形成期棕色又逐渐变浅。胚胎颜色与卵黄不断沉积的黑色素有关，在实际的生产育苗中，可以从受精卵的颜色变化简单的判断胚胎发育所处的时期，从而帮助人工育苗生产。另一个显著的特征就是眼睛，由于翻转期头部翻转到植物极，也就是粘附在产卵板上的受精卵朝外的位置，而眼睛黑色素沉积最多，所以在排卵约48h，远距离观察产卵板上的受精卵，可看到卵逐渐变黑。受精后160h也就是孵化前一两天眼睛开始变亮，反光性极强，这也是判断孵化时间的重要标志。

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第三章 盐度对公子小丑鱼幼鱼生长和生长激素及其受体mRNA水平的影响
公子小丑鱼，学名为眼斑双锯鱼，海葵鱼属(Amphiprion)，雀鲷科(Pomacentri- dae)，鲈形目（Perciformes）。分布于西太平洋低纬度礁岩海域。公子小丑鱼以其鲜艳的色彩、漂亮的花纹及可爱的形象而深受水族爱好者的喜爱。从1997到2002，公子小丑鱼占据了世界观赏鱼类总出口量15.6%和欧洲国家进口份额的25%以上[1]。
目前对于小丑鱼的专业性研究相对比较少，主要集中在生活习性[11,12]、分布[13,14]、分类等，对于其人工繁殖的研究虽有报道，但是尚不能进行大规模苗种培育。盐度作为海水鱼养殖中的一个重要的外界环境因子，与鱼类存活、生长和发育都有着十分密切的联系，尤其是对于小丑鱼这样长期生活在盐度较稳定的珊瑚礁区的鱼类。
生长激素(GH)是调节动物生长、发育等代谢过程的一个重要内分泌因子，GH发挥生理作用的第一步是与靶细胞膜表面的生长激素受体(GHR)结合[41]。长期以来人们在研究动物生长发育机制及其调控时,主要着眼于提高生长激素水平，然而GH必须与靶器官上生长激素受体(GHR)结合,由GHR介导将信号传入细胞内才能发挥作用[42]。作者通过生理与分子生物学的方法相结合，研究了盐度对公子小丑鱼幼鱼生长、摄食、饵料利用率和生长激素及其受体mRNA水平的影响, 旨在探索公子小丑鱼幼鱼阶段存活与生长的最适盐度条件, 以期为公子小丑鱼的进一步人工育苗生产提供更可靠理论资料，并为未来突破更多海水观赏鱼的人工繁育提供理论参考。

1 材料与方法
1.1 实验材料
本实验所用的450条公子小丑鱼幼鱼于2012年6月购自北京AMF海水农场，为90日龄左右。
总RNA提取试剂TRIzol®reagent购自美国Invitrogen 公司;反转录用试剂盒 PrimeScript™ 1st Strand cDNA Synthesis Kit购自日本TaKaRa公司,Real-time PCR 试剂盒SYBR® Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus)购自日本TaKaRa公司CR引物由上海生工生物技术公司合成;其余均为国产分析纯试剂。
1.2 实验方法
1.2.1 生长、成活率、摄食实验
    先暂养于四个的玻璃缸中（60×50×40cm）,控制养殖水温为27℃±1℃，pH为8.0-8.1，盐度为30，光照2500-5000lx，NH3-N水平低于0.5mg/L,NO2-N水平低于0.15 mg/L，NO3-N水平低于50mg/L。暂养一周后，摄食、生长逐渐正常,分组进行盐度实验。
实验共设15、20、25、30、35五个盐度梯度, 每个梯度设三个平行，盐度30组为对照组。实验在15个玻璃水族缸（60×50×40cm）内进行,每个水族缸内放入30尾幼鱼。每个盐度组的三个缸共用一个过滤缸（60×60×50cm），为上下共四层的一个水系统。各盐度试验用水为以色列RED SEA海盐和自来水配制而成，并用日本爱拓ATAGO S Mill-E型光学折射盐度计进行校正，曝气48h以上待用。投喂RED SEA海水鱼0.5mm专用饲料，
实验开始前24h停止投喂使其肠内排空，测量每组幼鱼的体长和体重，作为初始值。第42d和第70d分别将鱼全部捞出分别测量其体长和体重，测量体重前24h同样停止投喂。每天仔细的记录各盐度幼鱼的死亡情况并称重。在第70d测量体长和体重后，每个盐度梯度的一个平行组取6条鱼，一个盐度梯度共取18条鱼，分别取肝脏和脑组织样品，于液氮中保存带回实验室,  存放于－80℃冰箱以备之后的分子生物学实验。
每天投喂两次，并对颗粒饲料进行称重，记录各盐度每天的颗粒饵料投喂量。每天吸底换水一次，加水并调节盐度。

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1.2.2 生长激素及其受体mRNA水平实验
1.2.2.1  总RNA的提取
将在液氮中冻存的组织样品取出,匀浆后,使用Invitrogen公司的TRIzol®reagent试剂盒进行总RNA的提取。用UV-4802H 紫外可见分光光度计测量吸光值, 通过OD260/280 判断总RNA纯度, 用1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量,−80℃保存备用。
1.2.2.2  反转录及引物设计   
   根据TaKaRa PrimeScript™ 1st Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒操作说明, 将提取的总RNA进行RT-PCR 扩增获得cDNA。反转录产物于－20℃保存备用。根据本实验室已克隆出的公子小丑鱼生长激素基因,两种生长激素受体基因和β-actin 基因的序列, 设计特异性引物

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1.2.2.3  常规PCR
PCR扩增25μL体系为,cDNA模板1μL、2×Master Mix 12.5μL、10μmol/L上下游引物各0.5μL、双蒸水10.5μL 。反应条件为95℃预变性3min;95℃变性30s、62℃退火30s、72℃延伸30s,共39个循环;72℃延伸5min。
1.2.2.4  标准曲线制作
   
以公子小丑鱼肝脏、脑总RNA为模板进行反转录, 以Real-time PCR特异性引物为引物, PCR 扩增获得公子小丑鱼GH基因,2种GHR基因和β-actin 基因的片段。PCR 产物经1%琼脂糖电泳,按照e.Z.N.A®Gel Extraction Kit的操作说明对PCR 扩增片段进行纯化、回收。按照InsT/AcloneTM PCR Product Cloning Kit 载体连接试剂盒的操作说明将纯化产物与pGEM○R-T载体在T4DNA连接酶作用下进行连接反应,构建扩增产物的重组质粒。转化 DH5α感受态细胞, 涂于Amp、X-GaL和IPTG 处理的LB琼脂平板上, 37℃过夜培养, 挑取单个白色菌落, 在Amp+/LB液体培养基中37℃、200r/min过夜,按照参照质粒快速提取试剂盒E.Z.N.A®Plasmid Extrac-tion Kit 操作要求提取质粒,对所得重组质粒分别进行PCR 鉴定。采用核酸蛋白测定仪测定所提质粒样品的浓度,并将含有被测基因的片段的质粒按10—109梯度稀释,-20℃保存以备用于建立Real-time PCR标准曲线。

1.2.2.5  荧光定量PCR 扩增
   
    荧光定量PCR20μL扩增体系为cDNA模板1μL、SYBR® Premix Ex TaqTM 10μL、10μmol/L上下游引物各0.4μL、DEPC 处理过的双蒸水8.2μL。两步法PCR扩增标准程序:95℃预变性30s；95℃变性5s、61℃退火30s，共40个循环。

1.3 数据分析
   存活率=最终存活鱼数/初始鱼数×100%
   相对体重增长率=(平均每尾终末体重-平均每尾初始体重)/平均每尾初始体重×100%
   饵料转换效率=（实验结束幼鱼总重-实验初始幼鱼总重）/总摄食量×100%
    死亡个体初始体重体长以初始值计算，数据均以3个平行组所有数据的平均值±标准差(Mean±SD)表示；用SPSS 17.0软件对数据进行单因素方差分析(ANOVA)和Duncan多重比较，当P<0.05时认为差异显著。
    将各组样品所测基因的CT值与相对应的标准曲线相比照,即可得到该样品所测基因表达量的相对浓度值。最后采用目的基因与内参基因β-actin的比值来表示目的基因的相对定量结果。所有数据采用平均值±标准差(means±SD)表示。采用SPSS 17.0 统计软件来对数据进行单因素方差分析(ANOVA)和Duncan多重比较来检验统计差异,当P<0.05认为差异显著。